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pLVX-LexA-EGFP-CD63 病毒

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

          pLVX-LexA-EGFP-CD63，即Lentivirus expressing EGFP-CD63 fusion protein，是艾基自行研發(fā)的一種可以在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括原代細(xì)胞和干細(xì)胞)中通過(guò)CMV啟動(dòng)子表達(dá)人源CD63-EGFP融合蛋白的重組慢病毒。本產(chǎn)品可用于外泌體的示蹤研究，用于研究外泌體的形成、分泌、靶向和運(yùn)輸機(jī)制。本產(chǎn)品帶有嘌呤霉素 (Puromycin)抗性基因，感染細(xì)胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株。

          外泌體(Exosome)是膜包裹的細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，直徑約為40-160nm，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，天然存在于血液、尿液、腦脊液，以及體外培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中[1]，幾乎所有類型的細(xì)胞都可以產(chǎn)生并釋放外泌體[2]。如圖1所示，細(xì)胞膜內(nèi)吞(Endocytosis)依次形成初級(jí)內(nèi)體 (Early sorting endosome ESE)、次級(jí)內(nèi)體(Late sorting endosome , LSE) 和多囊泡體(Multivesicular body, MVB) ，其中多囊泡體包含腔內(nèi)囊泡(Intraluminal vesicles, ILVs) 。多囊泡體與細(xì)胞膜融合形成外泌體，外泌體攜帶多種來(lái)自其母體細(xì)胞的成分(包括核酸、蛋白質(zhì)、脂類和代謝物等)釋放到胞外基質(zhì)中[3]。外泌體可以被附近或遠(yuǎn)距離的細(xì)胞識(shí)別和融合，是細(xì)胞間進(jìn)行相互調(diào)控的重要媒介，參與了癌癥、神經(jīng)退行性病變和炎癥性疾病等多種疾病的發(fā)病過(guò)程，影響細(xì)胞多方面的的功能[4-5]。

圖1. 外泌體的形成原理及其攜帶的母體細(xì)胞成分示意圖。

          外泌體標(biāo)志蛋白（Protein biomarkers for exosome），也稱外泌體蛋白標(biāo)志物（Protein markers for exosome），可以用于鑒定、觀察、標(biāo)記和純化外泌體。據(jù)外泌體庫(kù) ExoCarta（http://www.exocarta.org）統(tǒng)計(jì)，來(lái)自不同生物、細(xì)胞類型和體液的外泌體中已發(fā)現(xiàn) 9769 種蛋白質(zhì)，ExoCarta 列出了 100 種常見(jiàn)外泌體蛋白標(biāo)志物（http://exocarta.org/exosome_markers_new），其中 CD9、CD63、CD81、ALIX、Flotillin、Ceramidase 和 TSG101 是最常用的外泌體蛋白標(biāo)志物（如圖 2 所示）。CD63 在人體中由 CD63 基因編碼的蛋白質(zhì)抗原，是跨膜四超家族（Transmembrane 4 superfamily）成員之一，為中次跨膜蛋白 [1]，大量存在于細(xì)胞外囊泡的表面，也會(huì)出現(xiàn)在普通的細(xì)胞膜表面。CD63 是最常用的外泌體蛋白標(biāo)志物之一，被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞外囊泡產(chǎn)生和胞內(nèi)物質(zhì)分選的關(guān)鍵因子 [6] 。

圖2. 常見(jiàn)的外泌體蛋白標(biāo)志物示意圖。

? pLVX-LexA-EGFP-CD63感染HEK293T細(xì)胞后的表達(dá)效果如圖3所示

TU                                                          1×10^5                                                          1×10^6

圖 3. 艾基生產(chǎn)的pLVX-LexA-EGFP-CD63感染HEK293T細(xì)胞的效果圖. 24孔板每孔100,000個(gè)細(xì)胞，

培養(yǎng)過(guò)夜后用相應(yīng)的病毒TU數(shù)進(jìn)行感染，病毒感染72小時(shí)后熒光顯微鏡實(shí)拍相同大小視野效果圖。

實(shí)際檢測(cè)效果會(huì)因檢測(cè)儀器、實(shí)驗(yàn)條件的不同而存在差異，本圖僅供參考。

          慢病毒感染細(xì)胞后會(huì)將目的基因隨機(jī)整合到基因組 DNA 上，因而可以長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)目的蛋白，并且?guī)缀蹩梢愿腥舅胁溉閯?dòng)物細(xì)胞，在很多不分裂的細(xì)胞中也可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

          本產(chǎn)品表達(dá)慢病毒抗性基因，因此本產(chǎn)品感染培養(yǎng)的細(xì)胞后可以使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株以用于后續(xù)研究。

          艾基的 pLVX-LexA-EGFP-CD63是復(fù)制缺陷慢病毒。其 3’ LTR 的增強(qiáng)子功能發(fā)生缺失，形成了自失活（self - inactivating）3’ LTR，并且 5’ LTR 中的 U3 區(qū)域替換成 CMV 啟動(dòng)子，在感染普通的細(xì)胞后不能進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增，從而有效降低了本產(chǎn)品在活體生物中的風(fēng)險(xiǎn)。

包裝清單

保存條件

        -80oC保存，一年有效。-20oC保存，兩周內(nèi)有效。4℃保存，3天內(nèi)有效。

注意事項(xiàng)

1. 收到病毒液后，如短期內(nèi)需馬上使用，請(qǐng)以 4°C保存(在 4°C保存條件下，病毒液請(qǐng)于一周內(nèi)用完)；如需長(zhǎng)期保存，則可分裝后存放于-80°C 。一般病毒可存放于-80°C約 6~ 12個(gè)月(病毒置于凍存管，并使用封口膜封口) ，如保存 6個(gè)月后使用，請(qǐng)重新檢測(cè)病毒滴度。

2. 使用前，請(qǐng)將病毒置于冰?。ɑ?/span> 4°C)中解凍。操作全程需將病毒置于冰盒中，保證低溫以穩(wěn)定其活性。

3. 我司提供的病毒以每管100μl，滴度在10⁸TU/mL以上進(jìn)行定量分裝，老師可根據(jù)實(shí)驗(yàn)加入不同的量使用。病毒凍融后可以按照實(shí)際使用情況進(jìn)行再次分裝，但一次凍融病毒滴度損失可能達(dá) 10 - 20%。分裝后的病毒也應(yīng)于-80°C乃至液氮保存。

4. 慢病毒的稀釋：用戶需要稀釋病毒時(shí)，請(qǐng)將病毒取出置于4度融化后，使用1x PBS 或無(wú)血清的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻稀釋至合適滴度后進(jìn)行細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，稀釋后的病毒在4°C保存條件下，三天內(nèi)需要用完（不建議進(jìn)行分裝凍存）。

注意：應(yīng)避免反復(fù)循環(huán)凍融慢病毒，這會(huì)導(dǎo)致病毒滴度大幅下降。

安全須知

        IGE 的慢病毒都是“ 自我失活”的，因?yàn)槲覀円褟牟《净蚪M中刪除了負(fù)責(zé)復(fù)制的基因，這也就意味著它們不能在靶細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并感染其他細(xì)胞。病毒仍然可以在理論上造成潛在的生物危害風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樗梢愿腥救祟愒?xì)胞，故我們強(qiáng)烈建議依照生物安全2級(jí)（BSL2級(jí)）標(biāo)準(zhǔn)要求處理病毒，生物危險(xiǎn)廢物貯存和處理方案必須與公布的標(biāo)準(zhǔn)相一致。

靶細(xì)胞感染方法

        我們建議您使用表達(dá)GFP的對(duì)照慢病毒來(lái)確定靶細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）。MOI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）是通常指每個(gè)細(xì)胞感染的最大病毒數(shù)；不同種類或不同來(lái)源的細(xì)胞，其最適MOI 各有差別。

        常見(jiàn)細(xì)胞MOI和感染條件可以參照附件1《常見(jiàn)細(xì)胞MOI和感染條件》內(nèi)容，但由于不同實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞存在狀態(tài)和培養(yǎng)條件的差異，第一次使用慢病毒時(shí)，建議先用對(duì)照慢病毒進(jìn)行感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定細(xì)胞最佳感染條件及MOI。

注意：

MOI值的計(jì)算：MOI值=加入病毒總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)，如一個(gè)培養(yǎng)孔中細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，加入 1×106TU的病毒時(shí)，侵染實(shí)驗(yàn)中MOI為10。

1、病毒感染貼壁細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)（以12孔板為例）

實(shí)驗(yàn)前按照不同的MOI值設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI值和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需要的病毒量，如有必 要可以使用PBS溶液或者無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液。

1.1 感染前一天（第 0 天）

將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代鋪板，使其在感染時(shí)達(dá)到 30-50％的匯合。鋪板后將細(xì)胞置于37°C， 5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育 18-20小時(shí)。例如，當(dāng)使用293T細(xì)胞時(shí)，我們通常在 12 孔板中每孔接種 1.5× 105 個(gè)細(xì)胞。

1.2 感染當(dāng)天（第 1 天）

將病毒從-80°C冰箱取出置于冰上解凍。根據(jù)所需的 MOI 取適量的病毒置于適量的培養(yǎng)基中，輕輕混勻（但不要渦旋）。為了最大限度地提高感染效率，可使用覆蓋板表面所需的最少量培養(yǎng)基。例如，當(dāng)在12 孔板中進(jìn)行感染時(shí)，我們每孔使用 0.5ml 培養(yǎng)基。

注意：如果細(xì)胞容易被感染，開(kāi)始以 MOI為1 到10 之間感染細(xì)胞。對(duì)于某些細(xì)胞系，可能需要更高的 MOI。

a. 從靶細(xì)胞中棄去舊培養(yǎng)基，然后將含有病毒的培養(yǎng)基加入細(xì)胞中。

b. 輕輕旋轉(zhuǎn)平板，在 37°C ，5％CO2 培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)。

注意：感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對(duì)最終的感染效率高低影響很大，所以務(wù)必保證加病毒之前細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。慢病毒對(duì)目的細(xì)胞的感染效率較低時(shí)，通過(guò)提高MOI 值可以增加病毒的感染效率，但必須注意細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是否受到影響。

很多細(xì)胞在培養(yǎng)基中加入終濃度為5-10 μg/ml的Polybrene可以提高病毒的感染效率。Polybrene可以增強(qiáng)慢病毒的轉(zhuǎn)染作用。Polybrene 是帶正電的小分子，可以細(xì)胞表面的負(fù)電荷相互作用以增加病毒衣殼和細(xì)胞膜之間的結(jié)合。Polybrene 可能對(duì)某些細(xì)胞有害。您可能需要首先測(cè)試細(xì)胞對(duì)Polybrene 的敏感性，濃度為1-10μg/ml。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類型，建議使用5μg/ml。

注意：過(guò)量接觸 Polybrene（＞12 小時(shí)）可能對(duì)某些細(xì)胞有毒害性。

c. 孵育4-6小時(shí)后，吸去含病毒的培養(yǎng)液：用正常培養(yǎng)液或PBS小心洗細(xì)胞2-3遍，最后加入合適體積的培養(yǎng)液過(guò)夜。

1.3 感染第3天

從第3天開(kāi)始，每天觀察細(xì)胞，如載體帶有熒光，則注意觀察熒光，并關(guān)注細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，如有必要進(jìn)行換液，以保證細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)于相關(guān)基因的檢測(cè)可采用Real-time PCR或WesternBlot；也可加入含有抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行藥物篩選，每 2-3 天更換含有抗生素的新鮮培養(yǎng)基。

注意：具有強(qiáng)代謝能力的細(xì)胞如293T 和BHK21細(xì)胞系，在轉(zhuǎn)染后24 小時(shí)則可表達(dá)熒光。然而，對(duì)于代謝緩慢的細(xì)胞如原代細(xì)胞、NSC 、MSC 等，GFP或mcherry等熒光的表達(dá)需要更長(zhǎng)時(shí)間，因此可能在轉(zhuǎn)染后 72-96 小時(shí)才觀察到熒光。所以在此期間應(yīng)及時(shí)更換培養(yǎng)基和傳代細(xì)胞，確保細(xì)胞健康生長(zhǎng)。